Polymorphisme de l'ADN

Les techniques issues de la biologie moléculaire permettent de rechercher des variations dans les séquences nucléotidiques de l'ADN et sont de plus en plus utilisées pour étudier le fonctionnement génétique des populations. Cette variabilité peut être recherchée dans des régions codantes de l'ADN mais de très nombreuses techniques permettent d'étudier le polymorphisme des régions non codantes qui composent la grande majorité des génomes. Cette variabilité, qui n'est généralement pas exprimée au niveau phénotypique, est utilisée pour définir des marqueurs permettant soit de caractériser des individus = empreinte génétique (ou finger print), soit de caractériser des populations, soit de cartographier des gènes.

Parmi l'ensemble des techniques disponibles, il faut distinguer celles qui permettent de mettre en évidence une variabilité dispersée dans tout le génome. Les marqueurs révélés sont alors multilocus et dominants.
D'autres techniques permettent de révéler une variabilité à des endroits plus limités du génome. Les marqueurs sont souvent qualifiés de monolocus et souvent codominants.

Il faut également distinguer parmi ces techniques celles qui nécessitent uniquement une extraction de l'ADN des individus étudiés de celles qui nécessitent une amplification in vitro d'une portion définie d'ADN par PCR (polymerase chain reaction).(illustration fixe) (illustration animée)

 

Sans être exhaustif, les principaux marqueurs moléculaires utilisés en génétique des populations sont les suivants:

Polymorphisme RFLP (Restriction fragment Length Polymorphism) et PCR-RFPL

Après extraction, l'ADN est soumis à une (ou des) enzyme de restriction qui coupe la molécule à des endroits précis, définis par une séquence de bases, appelé sites de restriction. Toute modification par mutation dans la séquence du site de restriction empêche l'action de l'enzyme. Cette non-coupure de l'ADN est détectée par une variation du nombre et de la longueur des fragments d'ADN (fragments de restriction) obtenus après digestion enzymatique, après séparation par électrophorèse et visualisation par hybridation avec une sonde radioactive ou fluorescente

Ce type de marqueur est codominant si le nombre d'enzymes utilisées est faible et s'il y a peu de sites d'hybridation de la sonde dans le génome. En faisant agir simultanément plusieurs enzymes de restriction, on étudie le polymorphisme à autant de sites particuliers qui se répètent tout au long de la molécule d'ADN.

L'utilisation de la PCR permet d'amplifier une région définie du génome puis d'appliquer la technique RFLP au produit PCR. Cette méthode appelée PCR-RFLP permet d'obtenir facilement des marqueurs codominants et évite l'étape d'hybridation et l'utilisation de sonde radioactive. Le produit PCR digéré par une (ou des) enzymes de restriction est simplement mis à migrer dans un gel d'agarose et le polymorphisme de la position et du nombre de bande est visualisé par une réaction colorée (Bromure d'éthydium BET).

Les séquences répétées en tandem ou minisatellites (VNTR)

Il existe dans le génome de très nombreux organismes des séquences nucléotidiques répétées en tandem les unes à la suite des autres. Le nombre de répétition est extrêmement variable entre individus d'où leur nom de VNTR (Variable Number of Tandem Repeat). Cette variation du nombre de répétitions est à l'origine d'un important polymorphisme dans les populations naturelles. On distingue 2 grands types de séquences répétées:

- les minisatellites qui sont des répétitions de motif ayant 10 à 60 paires de bases (pb)

- les microsatellites qui sont des répétitions de motif ayant 1 à 6 paires de bases (pb):
par exemple ATATATATATATATAT soit (AT)n n variable entre individus
CAGACAGACAGACA soit (CAGA)n

Les minisatellites peuvent être détectés par RFLP en utilisant des enzymes de restriction qui coupent un grand nombre de fois le génome mais jamais dans les minisatellites. Un polymorphisme de longueur de fragment est alors révélé par l'existence d'un nombre de répétitions différent entre individus, ce qui produit des fragments de tailles différentes. Ces marqueurs sont donc multilocus et codominants.
Les minisatellites sont révélés après PCR ce qui nécessite la mise au point d'amorces spécifiques. Cette étape est souvent longue et laborieuse mais permet d'obtenir des marqueurs monolocus et codominants.

Les RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)

Cette technique consiste à réaliser une amplification PCR avec des amorces d'environ 10 pb définies de façon aléatoire. Si les 2 sites d'hybridation sont suffisamment proches, l'amplification PCR est possible. Une variabilité dans la séquence des sites entre individus sera détectée par un polymorphisme du nombre et de la longueur des fragments d'ADN amplifiés. Cette technique a l'avantage d'être rapide avec peu de mise au point et révèle un polymorphisme important mais ce marqueur est dominant et les conditions de PCR sont très sensibles.
Une variante de la technique RAPD est d'utiliser des microsatellites comme amorces ce qui permet d'amplifier des régions comprises entre deux microsatellites (ISSR = Internal simple sequence repeat).

Les AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Cette technique est une combinaison des RFLP et des RAPD. L'ADN est dans un premier temps digéré par des enzymes de restriction puis des adaptateurs vont venir se fixer au deux bout des produits de digestion. Une amplification PCR est ensuite effectuée à l'aide d'amorces qui s'hybrident avec les adaptateurs et qui comportent en plus quelques bases choisies au hasard afin d'amplifier de façon sélective uniquement certains fragments. Une seconde PCR peut ensuite être effectuée pour réaliser une amplification plus sélective. Cette technique est très efficace pour révéler rapidement est facilement du polymorphisme.

Séquençage

La technique la plus performante est évidemment le séquençage complet des gènes, qui fournit le maximum de renseignements sur des fractions limitées et précises du génome, mais cette technique est peu compatible avec l'analyse d'un grand nombre d'individus d'une population. Quoi qu'il en soit, même si une partie seulement du génome a été explorée chez les eucaryotes, le polymorphsisme trouvé est suffisant pour entraîner une infinie diversité des génotypes individuels. Chaque génotype individuel correspond à un certain arrangement des divers allèles présents à chaque locus dans la population. C'est le principe du jeu de cartes : à partir d'un nombre limité de cartes différentes, qui représentent le patrimoine collectif des joueurs, la distribution qui est faite à chaque tour attribue à chaque joueur un jeu qui est pratiquement unique. C'est ici la méiose qui redistribue les allèles par le jeu de la recombinaison intergénique inter- ou intrachromosomique, et qui est responsable de l'infinie diversité des génotypes individuels.